上海天翎凈化工程有限公司

  1、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗(yàn)室;　　

  實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)AppliedBiosystems公司推出　　由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用?！?

  2、檢測(cè)設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求;　　

  熒光定量PCR儀+實(shí)時(shí)熒光定量試劑+通用電腦+自動(dòng)分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)?！　?

  3、必須通過(guò)國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心的驗(yàn)收和認(rèn)證;

  4、檢測(cè)人員必須通過(guò)國(guó)家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書(shū);　　

  5、必須在無(wú)菌無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)行操作

  下面介紹如何建立PCR實(shí)驗(yàn)室

  1、建立樣品準(zhǔn)備區(qū)　　

  ⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA不能在這個(gè)房間操作。

  ⑵組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。

  ⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子的工具，也不能用作操作靶序列。

  ⑷DNA樣品應(yīng)該用有專門(mén)的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。

  ⑸大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。

  ⑹管子打開(kāi)前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開(kāi)，這樣會(huì)產(chǎn)生氣溶膠。

  ⑺任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門(mén)用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗?！　?

  2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCRRNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會(huì)。為了避免這一問(wèn)題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道?！　?

  3、建立前PCR區(qū)。　　

  該去專門(mén)用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)，這個(gè)區(qū)域必須保持干凈，而且沒(méi)有來(lái)自和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門(mén)用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。　　

  4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作?！　?

  ⑴所用的所有溶液都應(yīng)該沒(méi)有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。

  ⑵所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過(guò)濾的，并且是高壓滅菌。

  ⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。

  ⑷所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。

  ⑸所有試劑和樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。

  ⑹新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。

  ⑺樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存。　　

  5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物。　　

  ⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。

  ⑵如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。

  ⑶作為一個(gè)規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照樣品來(lái)分析樣品配制和PCR前過(guò)程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過(guò)使用一個(gè)已知的弱陽(yáng)性樣品來(lái)驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。

  ⑷陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對(duì)照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。

  ⑸當(dāng)做陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用少數(shù)量的核酸。

  ⑹由于必須有對(duì)照反應(yīng)，對(duì)照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮?！　?

  6、控制污染的方法。　　

  已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來(lái)消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問(wèn)題，但可以將污染降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)?！　?

  7、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個(gè)專門(mén)用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門(mén)用于這一目的，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。