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海藻糖對生物酶制劑中反應(yīng)中激活劑與穩(wěn)定劑

溫度是影響酶反應(yīng)效率的重點因素之一，高溫能提高酶的催化活力，但易使酶失活。耐熱酶的發(fā)現(xiàn)為分子生物學(xué)帶來巨大的進步，如PCR和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)生，目前局限于從一些耐熱菌中分離得到耐熱酶，而且酶催化反應(yīng)類型也受到限制。研究發(fā)現(xiàn)海藻糖在高溫下能保持酶的正?；钚?，甚至起熱激活作用，還能用于提高干燥保存的酶的活性。在反應(yīng)體系中加入海藻糖，使熱敏感的酶在高溫下穩(wěn)定性和活性增加，可當(dāng)作耐熱酶使用，海藻糖的這一作用在生物藥學(xué)和工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。 未加海藻糖的限制性內(nèi)切酶Nocl在溫度由45℃升到50℃時失活，加了海藻糖時酶不但不失活而且活力繼續(xù)升高，說明海藻糖能抑制高溫下酶的失活；37℃時海藻糖能夠激活DNasel，加了海藻糖，溫度升到50℃時酶活力仍顯著升高；豬的胰脂肪酶在無水海藻糖介質(zhì)中可以耐受100℃高溫，有水時則會失活。有實驗表明海藻糖通過影響蛋白水合作用來穩(wěn)定和激活蛋白，它可以降低溶液中蛋白質(zhì)的水化作用，干燥時則能取代水或作為玻璃樣穩(wěn)定劑。海藻糖能阻止酶發(fā)生不可逆的熱凝聚-熱變性，與分子伴侶的功能相類似，實驗中將一些分子伴侶與海藻糖共同使用，能進一步擴大對酶具有熱穩(wěn)定和熱激活作用的溫度范圍。另外海藻糖并不是對檢測的所有酶都有熱穩(wěn)定和熱激活的作用，說明只有一些蛋白可能具有海藻糖識別和作用的位點。 獲得全長cDNA文庫，有利于分子和全長cDNA測序，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是構(gòu)建cDNA文庫的重要反應(yīng)，mRNA的二級結(jié)構(gòu)能夠終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，釋放mRNA/非互補cDNA雜合體，導(dǎo)致合成全長cDNA效率很低，這是構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫主要的問題。以前解決這一問題主要是在反應(yīng)前使樣品變性，如熱變性、加氫氧化甲基汞處理mRNA等或者反應(yīng)中提高反應(yīng)溫度。前一類方法對破壞mRNA二級結(jié)構(gòu)效果不佳，特別是從長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物獲得全長的cDNA，而后者雖然對破壞mRNA二級結(jié)構(gòu)比較有用，但除了TchDNA聚合酶外，其它反轉(zhuǎn)錄酶者不耐熱，而TchDNA聚合酶催化反應(yīng)需Mn2+，這容易造成mRNA在反應(yīng)前就降解了。實驗證明海藻糖能使鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶具有熱穩(wěn)定和熱激活特性，酶在60℃仍具有全部活性，足以在mRNA二級結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)終止反應(yīng)之前合成全長的cDNA，反應(yīng)效率大大提高。另外推測海藻糖可能具有改變核酸構(gòu)型的作用，例如減少反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中mRNA的二級結(jié)構(gòu)。 生產(chǎn)中利用海藻糖熱穩(wěn)定和熱激活的雙重功能，可以減少酶的用量和提高反應(yīng)速率，提高消耗/產(chǎn)出和時間/產(chǎn)出比值，在一系列酶反應(yīng)中都有很大潛力，如生化反應(yīng)、診斷或工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，更重要的是熱激活能用于提高反應(yīng)程度和總效率，獲得標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下不可能的產(chǎn)量。另外，利用熱穩(wěn)定和熱激活的作用，可開發(fā)以前在常規(guī)反應(yīng)條件下不可能進行的反應(yīng)，例如專一性要求特別高的核酸雜交實驗，反應(yīng)體系加入海藻糖，就可在適宜的溫度下同時使用幾種限制/修飾酶，提高雜交反應(yīng)特異性，減少假陽性結(jié)果。